聚合酶链式反应，简称PCR，是用于放大扩增特定的DNA片段的一种分子生物学技术，可以将它视为生物体外的特殊DNA复制，其最大的特征就是能将微量的DNA大幅增加。所以，不论是化石中的历史人物的残骸、古生物，还是凶手在几十年前遗留的毛发、血液、皮肤等，只要能将其中的一丁点DNA分离出来，就能在PCR技术下进行放大和对比。

1.聚合酶链式反应的原理

生物进化和传代的重要途径就是DNA的半保留复制。在多种酶的作用下，双链DNA可以变性解旋成单链，同时，根据碱基互补配对原则，在DNA聚合酶的参与下，能复制成同样的两分子拷贝。经实验发现，在高温条件下，DNA可以发生变性解链；而当温度降低后，DNA又可以复性成双链。所以，DNA的变性和复性，可利用温度进行控制，在加入DNA聚合酶、dNTP等引物，可以完成特定基因的体外复制。

聚合酶链式反应技术的基本原理，就像是DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。其基本反应步骤主要由变性、退火、延伸构成：（1）变性：经加热至93℃左右一定时间后，或者经过聚合酶链式反应技术扩增后，双链DNA会解离单链，能更好的和引物进行结合，并为下一轮的反应做好准备。（2）退火：经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，单链DNA会和引物进行互补、序列配对结合。（3）延伸：结合物（DNA和引物的结合体）在DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）、72℃温度的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性、退火、延伸的过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每次循环大概需要2分钟至4分钟的时间，在2小时至3小时左右的时间就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

2.聚合酶链式反应的特点

特点一：特异性强。在聚合酶链式反应中，模板和引物的结合、引物链的延伸都是在碱基配对原则下进行的。在较高的温度下，反应中模板与引物的结合都是依靠TaqDNA聚合酶耐高温性与聚合酶合成反应的忠实性进行的，大大增加了结合的特异性，保持了被扩增的靶基因片段较高的准确度。同时特异性和保守性高的靶基因区选择，能进一步提升其特异性的程度。

特点二：聚合酶链式反应产物的生成量，是以指数方式增加的，能将皮克量级的起始待测模板扩增到微克水平。PCR技术能从100万个细胞中检出一个靶细胞，同时，在检测病毒的过程中，PCR的灵敏度可达3个RFU，而在细菌学中，PCR技术的最小检出率为3个细菌。

特点三：简便、快速。聚合酶链式反应技术，可采用耐高温的TaqDNA聚合酶，在将反应液一次性加好后，就能在DNA扩增液和水浴锅上，开展变性、退火、延伸三个过程的反应，通常情况下，扩增反应可在2h至4h左右完成。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，其优势在于无放射性污染、易推广。

特点四：核酸纯度要求低。聚合酶链式反应，无需分离病毒、细菌及培养细胞，扩增模板可用DNA粗制品及RNA。可直接用临床标本，如细胞、活组织、洗漱液、毛发、血液、体腔液等DNA进行扩增检测。

3.聚合酶链式反应中常见的问题

问题一：假阴性。若聚合酶链式反应失败或者没有扩增条带，就需要分析和排查聚合酶链式反应的几个关键性环节：（1）聚合酶链式反应的循环条件。（2）酶的质量及溴乙锭的使用。（3）引物的质量与特异性。（4）模板核酸的制备。

问题二：假阳性。若聚合酶链式反应的扩增条带与目的序列条带不一致，如出现拖带、同时出现特异性扩增和非特异性扩增条带、偏大偏小等情况，就需要分析和排查原因：（1）加入试剂或样品引起的交叉污染；（2）加样器通道形成气溶胶，造成加样器通道污染；（3）扩增产物的污染等。

（榆林市第一医院检验科 白珍珍）